人文再造网膜增加罗德分片由人类视网膜Epitherium+++TVST++ARVO杂志

抽象性

目标:前文显示Bruch薄膜老化视网膜缩影此处,我们判定BM再工程对RPE分解效果

方法论:BM脱机从老幼捐赠者眼神解剖旧式BM脱机用Triton X-100清洗和/或外细胞矩阵涂层ARPE-19细胞-衍生ECM(ARPE-ECM)用亚硝酸钠修改ARPE-19细胞培养并发荧光标为牛外段(ROS)配入带或无ffaV5negrin抗体的细胞图像采集和分解量化由荧光显微镜和图像J分析完成

结果:净化老式捐献者-衍生BM冲刷水量不增加ROS摄取量,而清洁加涂层与ECMligands并发会显著提高RPE分片分解量(54.9++6.2 vs.83.5+6.5任意单元P级< 0.05)接近青年捐赠者BM(123.6+9.9自理单元)。观察对受同样处理的一元修改ARPE-ECM产生类似效果ALV5阻塞反体并使用ROS显著下降RPE分机

结论:老化BM对RPE分片分解的有害影响可以通过再造BM表面并用洗涤清洗并重编码ECMligands来扭转

翻译相关性:研究结果显示移植RPE细胞的治疗成功至少部分需要重构疾病BM,使之更适合RPE依存、生存和适当功能环境

导言

健康人眼视线色素单片组分Bruch薄膜内部部位并分离神经视网膜和Choiocablyis ^一号,2RPE侧面环绕杆形外段,RPE柱面与基底膜接触,这是薄多拉度结构最深层与合影相邻层 ^一号,2RPE执行数大功能维护神经视网膜,包括光受体外段分片分片分解分解分解、视觉色素处理和更新、提供屏障函数和向神经视网膜转移养分 ^2-4为使RPE单层完整性得到维护,RPE必须适当附着BM和相邻RPE细胞间 ^4,5RPE和BM内部部分之间的附加关系由integrin受体介于RPE和basallamina内ligands中,包括laminin、fronectin和collagen四型 ^6-8

与年龄有关的畸形疾病影响外视网膜、RPE、BM和choiocablyis ^九九,10失序特征表现为BM内与年龄有关的超结构变化,包括扩散厚度积聚、basalliminar和basal线性沉积、collagen内外交叉连接collagen层、计算化、Exlitin层分解和脂化 ^11-15高级AMD细胞变换包括RPE萎缩性、合iocapriis和外视网膜非解释性AMD开发 ^16-18号当前尚不知晓BM观察到的超结构变化与AMD开发的细胞变化之间的关联已知BM内部由老化引起的结构变化先于RPE细胞变化一二十年,远早于临床检测和成像AMD ^{11,14,19号,20码}

人眼Vivo,RPE和BM时代并发,因此无法分离BM老化和细胞老化初级效果实验室开发出系统分离BM内部老化效果和RPE老化效果 ^21号-23号系统显示老化BM会减少人类RPE对BM内部部分的依存性、附后生存性、扩散性以及变换RPE基因表达式 ^21号-25码最近,我们证明BM老化会降低RPE单层培养到入网鼠外段的能力 ²⁶硝酸处理RPE外细胞矩阵模拟老化BM效果 ²⁶有趣的是,BM扩展矩阵对RPE附加物、生存量和扩散量的影响可以通过用Triton X-100清洗BM表面并用Laminin、Fibronectin和Vitronectin混合覆盖表层而反转 ^27号判断重构老捐赠者-衍生人-BM是否可提高RPE积分电容

方法论

复用ARPE-19细胞文化推广

人类不失效RPE细胞(ARPE-19细胞线)取自American类型文化集合(ATCC,#CRL2302!manassasVA按ATCC定义被培养传播卡尔斯巴德CAARPE-19中型装有Dulbeco修改老鹰中型-F12-DMEM-F12N-2-Hible-Iporazine-N#2-Enestalfonice缓冲值(#11330)补充10%子牛血清(#16000-044)和1X抗生素-AntimycoARPE-19槽密度为35-50x10 ³细胞/水井96ell板块(法兰克林湖,NJ)并允许在实验前实现汇合细胞孵化于5%CO5%的潮湿空气 ₂95%空气为37摄氏度,文化媒体每周三次修改此处描述的所有实验均使用ATCC的ARPE-19细胞线进行

隔离Bruch薄膜

BM前置植物通过国家疾病研究交换从人体捐赠者获取(Philadelphia,PA)。所有捐赠者眼睛表28-10小时内拆卸并运至实验室BM脱机采集并处理前述 ²⁶简言之,从青年(9至46岁)和老(74至81岁)捐赠者处获取BM前置植物表2)从每个捐赠者提取二片外茄并用北面BM层 ^23号,28码双目无二维介质并分解类-BM-RPE综合体原生RPE电池在室温20分钟内以0.02M氢氧化物孵化除去后再用磷缓冲盐水冲洗每种茄子都以介质浮上带0.5微米薄膜的疏水多丁基乙烯宽度125至175米(RPEbasallamina正对薄膜)。后,4%agarose从染色板侧倒入BM类综合体并立即置址4摄氏度下一波多氟乙烯膜脱落6毫米圆形按钮从外围BM单片上截取Teflon并放在三十七摄氏4%agaroseagarose允许在室温下固化,三次轻扫PBS

表2

视图表

八小时内对捐赠者视线进行核处理并处理实验室四十八小时内BM隔离

隔离波音罗德外段

BovineROS与前文描述的隔离 ²⁶简言之,新牛眼从本地屠宰场采集并用冰运到实验室Hanks用桶盐解法洗眼热科学Wathamma)含100U/mLpenicllin和0.1mg/mlsteptomycin生命技术)前端半眼被取出并丢弃,视网膜/RPE通过轻滑HBSS插入子关系空间分离并分离视网膜放入冰面玻璃管中,内含隔离介质20%sucrose,20mMTris-Cl,2mMMMM ₂和130mNACl(pH7.2)并实现同质化一毫升视像同质层叠加10%至60%sucrose梯度和离心机141,000 g级4摄氏2小时ROS沉积27%至50%sucrose梯度装有ROS的带收集7700时通过离散标取 g级4摄氏度为10分钟,缓冲盐溶液悬浮,800分再次分解 g级10分钟净化ROS存储于4摄氏度DMEM中,含17%sucrose和Pen/Strep使用前ROS离心机9000 g级10分钟清除存储介质外段富集度从0.1%安莫尼克斯LO中测量分光谱 ²⁹

荧光标签单片

隔离ROS贴上氟辛异常(FITC,#F7250!西格玛阿尔德里希Louis,MO)ROS用HBSS解析并悬浮于0.1M单碳酸钠缓冲pH9-9.5FITC二甲基二亚化溶解到2 mg/ml,并加入ROS最终浓缩到10-50ng/mFITC染色ROS洗两次,用微离心管切片(4分钟4500 g级并悬浮生长介质集中度为0.4微克/微克荧光标签ROS随后播入96行盘中培养细胞,集中度4至5mg/cm ²,对应1.5x10 ⁵粒子/cm ²5x10 ⁴外段粒子/井)微镜检验标签ROS显示标签后完整外段(数据未显示)。

编程硝化外细胞矩阵

RPE派生EMM和随后nitrite处理的生成前曾描述过 ²⁶简言之 30-50x10 ⁴ARPE-19细胞板块96行并堆约6至8周,以便电池有充裕时间组成ECM取出细胞后增加100微L/well20m氢氧化缓冲20分钟,然后用PBS洗三次,并在文化引擎内擦干空气以获取由ARPE-19衍生ECM覆盖的96well板ium亚硝酸-经处理ECM编译7天 pH4acetate缓冲水井至少用PBS清洗四次,用PBS孵化4小时,并再次清洗至少两次以完全清除i ^30码

洗净和/或编译人类Bruch薄膜和外细胞矩阵

RPE派生EM处理或人工BM脱机损耗处理如前所述 ^26,27号创建条件:(1)清洗BM/ECM,4°C处理0.1%Triton-X/0.1%,20分钟复元二百五十微克/毫升vicronectin,33微克/毫升,37摄氏30分钟)或(3)未经清理或涂层处理表面,这些都用作控件清洗和/或涂层后3次用PBS冲刷5分钟并存储在4°C,48小时内使用或冻结在-20°C,紧接使用前解冻

编程RPE细胞编译FITC-Labeed Rode外段

ARPE-19单元(30-50x10 ⁴)播入BM脱机或RPE衍生ECM96well板块并培养并发(10-14天)。后,ARPE-19细胞用20%FBS向DMEM-F12中FIT标签ROS供养约16小时手机与DMEM-F12多次冲刷清除FITC标签ROS并反染Hoechst核染色热科学,RockfordIL)前定点2%假冒药效达10至15分钟,并用1xDulbecco PBS(LifeTechnology)多次冲刷紧接固定后,使用CellAlyzer2000机获取荧光图像(GE保健生命科学PiscawayNJ),目标x40使用紫外线和FITC滤波取时课程实验时,FITC标签ROS播入细胞,每2小时连续洗新套重复水井12小时,接续反封存、固定和获取图像如上所述块形细胞化除FITC标签3小时ROS外,还用反ALV5内特格林反机体孵化3小时,详情见别处 ^31号

统计分析

所有实验都用复数并重复至少三次值用Excel分布表和生成图绘制表示均值++SD值意义使用Scients判定 t级测试

结果

前文显示,从老年人眼中生成的BM会降低RPE表面培养ROS体外分解ROS的能力 ²⁶并用洗涤器清洗老式捐赠者-衍生BM并用ECM蛋白重新装箱提高覆盖RPE细胞生存率、扩散率和附加率至接近控制水平 ^27号或清理加封受损表面(二元机或老式投送者-源代码BM)影响ARPE-19细胞将ROS划入与年轻BM相似水平的能力单用洗涤剂处理旧式BM并不会改变ARPE-19单层功能比控件分片ROS 微博一号)洗涤净化器后再重编BM与ECM专用蛋白质提高ARPE-19细胞分片ROS容量微博一号54.9+6.283.5+6.5任意单元 P级=0.009发素水平没有恢复到小BM细胞水平,值比旧BM高25%,表示ECM蛋白在这一基本RPE函数中发挥了关键作用(RPE函数中关键作用)( 微博一号年轻123.6+9.9单元54.9+6.2自理单元旧+清洗包覆83.5+6.5 N级11双眼并表2统计学)

图1

ARPE-19细胞分解小机和老机重构BM青发BM(123.6+9.9任意单元)对老发BM(54.9++6.2任意单元)(栏1对栏2!P < 0.001)清扫旧BM表层变色液和纳阵列(572++8.5自理单元)没有增加分解分解法(2栏对3栏!P=0.45重构旧BM与老BM之比(2栏对4栏!P=0.009重构BM没有提高分机性能, 与小BM高测值相似(第一栏对第四栏! ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++P=0.008防腐剂清洗ECM添加 Laminin、vicronectin和Fibronectin

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ARPE-19细胞分解小机和老机重构BM青年BM(123.6+9.9任意单元)对老BM(54.9++6.2任意单元)(栏1对栏2); P级< 0.001)旧BM表层净化法和纳阵列法(572++85任意单元)没有增加分解法(2栏对3栏); P级=0.45重构旧BM与旧BM之比(2栏对4栏); P级=0.009BM再工程没有以与年轻BM高测值相似的方式改善分解法(第一栏对第四栏); P级=0.008防腐剂清洗ECM添加 Laminin、vicronectin和Fibronectin

测试模拟老化对ARPE-19细胞分离ECM的影响要做到这一点,我们用亚硝酸钠处理ECM非同步化处理它,它交叉连接蛋白质并充当基底膜老化的体外模型 ^28码itite处理可按预期减少ARPE-19细胞ROS的分形 ²⁶洗涤和重装混合ECM蛋白质使培养ARPE-19细胞的分片容量比亚硝化物处理样本增加约33%(比亚硝化物处理样本增加约33%)( 微博2亚硝酸钠252.0+30.5对PBS423.0+38.5任意单元 P级=0.005和人造BM一样,洗涤处理二元修改ECM单方并不足以改善分解性(未显示)。

图2

ARPE-19单元分解ARPE-19-派生EMMA)用亚硝酸钠处理的ECM降低了ARTE-19单元覆盖量与未经处理(磷缓冲盐碱控制)(252+24.2 vs.542+30.5专制单元P < 0.001)带洗涤剂(Dit)并重铺ECM+EMM配有特定蛋白质(Iminin、Fibronectin、Vitronectin)提高ARPE-19分词能力(252+242对s423+242随机单元P=0.005代表图像A板条件Hoechst核染色物(第一列)、FITC标签ROS(第二列)和FITC图像叠加核染色物(第三列)。控件(bc)显示柱状分解FITC标签的ROS分片细胞下降,这些细胞生长自亚硝酸处理样本中(比较efbc重构(h,i)企业内容管理显示FITC标签ROS分解比亚硝化处理样本(e,f)明显增加a至i标度栏,10m内置和第四右列(一二三)描述代表区c、f和i(小方块)显示每个处理组高放大细胞伸展栏极右角5m

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ARPE-19单元分解ARPE-19-派生EMMA)用亚硝酸钠处理的ECM降低了ARTE-19单元覆盖量与未经处理(磷缓冲盐碱控制)(252+24.2 vs.542+30.5专制单元 P级< 0.001)带洗涤剂(Dit)并重铺ECM+EMM配有特定蛋白质(Iminin、Fibronectin、Vitronectin)提高ARPE-19分词能力(252+242对s423+24.2任意单元 P级=0.005代表图像A板条件Hoechst核染色 第一列FITC标签ROS 第二列核染色FITC图像叠加 第三列)控件 b/, C级显示阵形分解FITC标签的ROS分片细胞下降,这些细胞生长自亚硝化处理样本(比较) e类, f级带 b/, C级)重构型 h, 一企业内容管理显示FITC标签ROS分片比亚硝化物处理样本明显增加 e类, f级) 尺度栏For a/至一10微米内置并 第四右列高山市一, 二, 三描述代表领域 C级, f级并一高山市 小方块显示电池高放大度 尺度栏内 极右角角5微米三集中 第四列[ 一, 二, 三))

图2

ARPE-19单元分解ARPE-19-派生EMMA)用亚硝酸钠处理的ECM降低了ARTE-19单元覆盖量与未经处理(磷缓冲盐碱控制)(252+24.2 vs.542+30.5专制单元 P级< 0.001)带洗涤剂(Dit)并重铺ECM+EMM配有特定蛋白质(Iminin、Fibronectin、Vitronectin)提高ARPE-19分词能力(252+242对s423+24.2任意单元 P级=0.005代表图像A板条件Hoechst核染色 第一列FITC标签ROS 第二列核染色FITC图像叠加 第三列)控件 b/, C级显示阵形分解FITC标签的ROS分片细胞下降,这些细胞生长自亚硝化处理样本(比较) e类, f级带 b/, C级)重构型 h, 一企业内容管理显示FITC标签ROS分片比亚硝化物处理样本明显增加 e类, f级) 尺度栏For a/至一10微米内置并 第四右列高山市一, 二, 三描述代表领域 C级, f级并一高山市 小方块显示电池高放大度 尺度栏内 极右角角5微米三集中 第四列[ 一, 二, 三))

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先前的研究显示,将ROS注入ARPE-19细胞2小时后,几乎所有ROS都仍然与细胞膜受体相关联(ALVBETY5),5小时后约50%仍归表面受体,其余部分则内化 ^31号调查ARPE-19细胞处理系统运动性能,我们向FITC标签ROS提供FITC标签并在随后的12小时中每隔2小时对二元处理对二元控制ERP源ECM进行荧光测量两组二小时前没有统计上的重大差分4小时后,ROS处理中二元控制处理出现显著差异,并持续最长12小时(最长12小时)( 微博3)

图3

时间周期分析ARPE-19控件和一元处理ERMatrite处理和控制组间差异在ROS交付后前2小时内可见,但在统计上无关重要(NIT, 29++6.8对PBS, 47++10.3!P=0.16ROS交付后四小时,二元处理控制组间分差显著化(NIT,51++7.8对PBS,109++10.3!s < 0.001)其余实验中这些差值仍然很大(NIT6小时82+10.2对PBS170+9.2,*P < 0.001!8小时NIT99+15.7对PBS201+17.610小时NIT93+11.6对PBS272+33.712小时NIT123+14.0对PBS317+27.3*P <0.001)。

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时间周期分析ARPE-19控件和一元处理ERM亚硝酸处理和控制组间差异在ROS交付后前2小时内可见,但在统计上无关重要(NIT, 29+6.8对PBS, 47+10.3; P级=0.16ROS交付后四小时,二元处理控制组间分差显著化(NIT,51++7.8对PBS,109++10.3!* P级< 0.001)其余实验中这些差值仍然很大(NIT6小时82+10.2对PBS170+9.2* P级< 0.001!8小时NIT99+15.7对PBS201+17.6* P级0.00110小时NIT9311.6对PBS272+33.7 P级< 0.001!12小时NIT123+14.0对PBS317++27.3 P级< 0.001)

之后,我们试图检验ROS粒子内部化是否涉及ARPE-19细胞表面的a+V5内晶接收器,ARPE-19细胞是主受体与ROS初始识别绑定相联 ^31号为此,我们在文化介质中添加反ALV5反体和FITC标签ROS显示于图4++++++++++++5910.9+114.8自理单元 P级< 0.001)硝酸盐处理样本似乎受αV5抗体阻塞作用更大,显示比无争议对口单位下降约90%(NIT+ROS,1825.1+177.2对NIT+ROS+ALV52105+17.3任意单元); P级< 0.001)添加非专用ImmunugloblinG没有产生任何实质性效果(未显示)。

图4

ROS处理被抗体阻塞向含有ROS3小时的介质添加50微克/毫升抗ARTE-19细胞(ROS+ffaV5)比样本无阻抗体(910.9114.8 vs)下降2925.6+120.8任意单元P < 0.001[P=1.4x10-13])类似地,NIT处理样本中ARPE-19细胞(NIT+ROS+ALVBY5)加阻塞反转机比无反转机样本(NIT+ROS+ROS2105+17.3vs1825.1+177.2任意单元P < 0.001[P=2.7x10-9])

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ROS处理被抗体阻塞向含有ROS3小时的介质添加50微克/毫升抗ARTE-19细胞(ROS+ffaV5)比样本无阻抗体(910.9114.8 vs)下降2925.6+120.8任意单元 P级<0.001 P级=1.4x10 ^-13))类似地,NIT处理样本中ARPE-19细胞(NIT+ROS+ALVBY5)加阻塞反转机比无反转机样本(NIT+ROS+ROS2105+17.3vs1825.1+177.2任意单元 P级<0.001 P级=2.7x10 ^-9))

讨论

研究中,我们研究是否可以扭转BM老化对ARPE-19单元分形功能的有害影响光用洗涤剂处理旧BM并不会提高RPE手机线对phacetoseROS的能力取而代之的是,洗涤剂与企业内容管理蛋白混合似乎使BM恢复活力,从而增强这些细胞的分片容量相似结果使用我们先前开发的企业内容处理老化模型 ²⁶仿生BM老化处理单用洗涤剂处理一元修改地下室膜并不能提高RPE剖析ROS的能力混合净化除尘器后加企业内容管理蛋白似乎恢复一元修改企业内容管理,从而提高ARPE-19单元的分片容量ROS内化统计上有显著差异,控件和亚硝酸处理样本从4小时开始持续至少12小时(持续时间至少12小时)( 微博3)+反AffaVDIE5降低手机荧光强度比无抗体样本减少70%至95%(无抗体样本减少70%至95%)( 微博4)

AMD主因未知,但多行调查旨在说明BM老化与该疾病所见细胞变换之间的联系,如RPE萎缩和光受体变换 ^{10,11,14,18号,20码}BM内部与年龄相关变化数十年前发生,从而表示BM机能失常可先发制人并诱导周围细胞变化 ^{14,15,19号,20码}系统先前开发分离基底膜老化效应和细胞老化效应,我们显示BM老化会影响RPE细胞的适当依存和扩散并增加他们的吸附率同时降低分解率 ^27号,28码人造BM可改善RPE的依存性、生存性与扩散性 ^27号在本报告中,我们显示重构老式捐赠者-衍生人BM净化并随后重编ECM蛋白质可提高ARPE-19细胞表面培养的方位能力这表明其他因素也与老化过程和细胞分片分解功能下降相关联。BM内部的分子级可能因时间关系而发生其他有害变化,例如其他形式的酶性或非酶性蛋白交叉联系(例如非减值糖类、活性氧类和活性氮类)。 ¹⁰此外,BM老化还可能影响其他蛋白质(例如Heparan硫酸盐),这些蛋白质可能在RPE总体功能中发挥重要作用。 ^20码这些结果不足为奇,因为BM内老化的分子变化本质上是先质性,不完全理解。尽管如此,通过提供新的ECM蛋白质而增加扩散、生存和RPE功能的事实在其他系统中可能也很重要,这些系统设计来复制人工BM ^32码最新一份报告描述初级RPE细胞如何成双向单层生长和扩散,三维脚架由Collagen类型1制作和材料称为多词双曲酸 ^32码Fibrillary网络类似于FibrillarBM相层结构,细胞在形态学和分子学上与RPE相似并显示正确分极单层 ^32码额外涂层带ECM蛋白质可能对移植RPE单层整体功能产生长期积极影响

RPE是人体中最活跃的分片缩影维夫约3%-5%光接收器外段每日脱机,需要适当的RPE分解以保持神经视网膜和合影管的健康和完整性 ^{三十三,34号}RPEphacroisce使用SAVDI5内分片表面接收器初始外段单元绑定,MERTK内化和寻宝器CD36 ^{31号,35码,36号}中断进程的任何步骤都可能导致病理学举例说,缺少aV5的小鼠无法内化外段导致视网膜变换 ^{37号-三十九}merTk缺陷导致皇家外科大鼠学院和转基因小鼠视像变换 ^38号,40码人体外段清除量下降可能导致RPE内部外段积聚,RPE与AMD相关联 ^41号,42号

前文显示二硝酸钠修改ECM会降低RPE细胞的划线能力,其程度可与老化BM相仿 ²⁶此外,一元修改会减少RPE对ECM的附加作用,抑制细胞扩散并增加potosis ^43号硝酸盐通过体内和体内科兰根非增益交叉连接产生这些效果 ^{30码,44号,45码}类似BM使用洗涤剂处理ARPE-19-ECM(Tripon X-100)并重构ECM蛋白这些结果显示,人类BM老化可模拟ARPE-19非增分解体积ECM,可减少ARPE-19细胞外段分解分解分解分解,而这一下降至少可以通过混合洗涤法和ECMligands重布面来部分反转退。BM ECM蛋白原结构变硬法也可能间接地产生RPE机能失灵,产生活性氮种,转而对细胞蛋白产生有害影响。 ^45码-47然而,老化BM中二元修改模数与年龄相关积聚 ^48号并影响蛋白质机能 ^49号推荐nitation作用与年龄关系下降 RPE生存功能恢复企业内容管理扭转功能损失是扭转RPE机能失灵导致AMD的重要一步最后,我们显示,所观测到的多数(如果不是全部)分解器均通过a+V5受体进行介导,该受体是一个关键播放器,它最初具体识别RPE细胞中的ROS ^34号,35码需要额外研究来确定初级RPE或RPE取自人类胚胎干细胞或导出多功能干细胞对自发老化或一元化EMM表面行为相似实验室持续实验旨在理解BM应用对iPSC派生RPE细胞的影响实验将加深理解企业内容管理对从不同语系和基因背景衍生的 RPE细胞生理维护与功能特性的重要性

老龄化是一个复杂现象,涉及细胞内部及其外部环境的改变,包括全体企业内容管理余生积聚表现为RPE内细胞内唇阴素积聚,人眼macula中RPE软化速率依年龄增长外围不见相似变化 ^41号,50码紫外线光和其他诱发脱氧核糖核酸损坏的物剂可加速细胞内病理变化 ^51号-53号除细胞变换外,还可能在BM中发生老化变换,包括非振荡消化、collagen交叉连接和弹性片分解 ^{14,19号,43号,44号}在我们模型中,与年龄有关的人类BM变化可能包括但不限于非振荡消化,可能导致RPE功能大打乱,包括RPE发理体外研究证明这些变化可以通过表面清洗涂层反转需要额外研究开发处理法以产生无毒体相同效果

感知感知

部分由一笔不受限制赠款支持南卡罗来纳医科大学风暴眼学院从研究到预防盲目Macula协会克利夫兰和基金会消除盲目,ExcesMills,MD

披露: E.F.莫雷拉无; H.市无; T.H.泰泽尔无; M.A.字段无; L.V.德普里叶无

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图1

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ARPE-19细胞分解小机和老机重构BM青年BM(123.6+9.9任意单元)对老BM(54.9++6.2任意单元)(栏1对栏2); P级< 0.001)旧BM表层净化法和纳阵列法(572++85任意单元)没有增加分解法(2栏对3栏); P级=0.45重构旧BM与旧BM之比(2栏对4栏); P级=0.009BM再工程没有以与年轻BM高测值相似的方式改善分解法(第一栏对第四栏); P级=0.008防腐剂清洗ECM添加 Laminin、vicronectin和Fibronectin

图2

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ARPE-19单元分解ARPE-19-派生EMMA)用亚硝酸钠处理的ECM降低了ARTE-19单元覆盖量与未经处理(磷缓冲盐碱控制)(252+24.2 vs.542+30.5专制单元 P级< 0.001)带洗涤剂(Dit)并重铺ECM+EMM配有特定蛋白质(Iminin、Fibronectin、Vitronectin)提高ARPE-19分词能力(252+242对s423+24.2任意单元 P级=0.005代表图像A板条件Hoechst核染色 第一列FITC标签ROS 第二列核染色FITC图像叠加 第三列)控件 b/, C级显示阵形分解FITC标签的ROS分片细胞下降,这些细胞生长自亚硝化处理样本(比较) e类, f级带 b/, C级)重构型 h, 一企业内容管理显示FITC标签ROS分片比亚硝化物处理样本明显增加 e类, f级) 尺度栏For a/至一10微米内置并 第四右列高山市一, 二, 三描述代表领域 C级, f级并一高山市 小方块显示电池高放大度 尺度栏内 极右角角5微米三集中 第四列[ 一, 二, 三))

图3

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时间周期分析ARPE-19控件和一元处理ERM亚硝酸处理和控制组间差异在ROS交付后前2小时内可见,但在统计上无关重要(NIT, 29+6.8对PBS, 47+10.3; P级=0.16ROS交付后四小时,二元处理控制组间分差显著化(NIT,51++7.8对PBS,109++10.3!* P级< 0.001)其余实验中这些差值仍然很大(NIT6小时82+10.2对PBS170+9.2* P级< 0.001!8小时NIT99+15.7对PBS201+17.6* P级0.00110小时NIT9311.6对PBS272+33.7 P级< 0.001!12小时NIT123+14.0对PBS317++27.3 P级< 0.001)

图4

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ROS处理被抗体阻塞向含有ROS3小时的介质添加50微克/毫升抗ARTE-19细胞(ROS+ffaV5)比样本无阻抗体(910.9114.8 vs)下降2925.6+120.8任意单元 P级<0.001 P级=1.4x10 ^-13))类似地,NIT处理样本中ARPE-19细胞(NIT+ROS+ALVBY5)加阻塞反转机比无反转机样本(NIT+ROS+ROS2105+17.3vs1825.1+177.2任意单元 P级<0.001 P级=2.7x10 ^-9))

表2

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八小时内对捐赠者视线进行核处理并处理实验室四十八小时内BM隔离

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