2022年1月
第63卷,问题1
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视网膜细胞生物 2022年1月
PKA和EPAC1 减少Nek7阻塞视网膜瓦
李刘 ; 江江 ; 捷那J斯坦立尔
作者关联注解
  • 李刘
    美国密歇根底特律韦恩州立大学医学院眼科解剖科
  • 江江
    美国密歇根底特律韦恩州立大学医学院眼科解剖科
  • 捷那J斯坦立尔
    美国密歇根底特律韦恩州立大学医学院眼科解剖科
  • 通讯:JenaJSteinle,Wayne州立大学医学院眼科解剖科914Scott Hall540ECanfield底特律MI48202美国 jsteinle@med.wayne.edu.
视觉科学调查 2022年1月63卷14多伊:https://doi.org/10.1167/iovs.63.1.14
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      刘易德江市斯坦福尔PKA和EPAC1 减少Nek7阻塞视波投资公司Ophthalmol大学维斯科学文献2022;63(1):14多伊:https://doi.org/10.1167/iovs.63.1.14.

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      ARVO(1962-2015)作者群(2016-present)

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抽象性

目标:确定蛋白状a和交换蛋白质caMP1抑制NIMA7相关hone7Nek7阻塞NOD相似受体家族带域成员3

方法论:视距内延细胞生长正常(5mm)或高(25mmgglucese)部分细胞使用Nek7cDNA标语Epac1反战者PKA反战者或空向量EPAC1浮5-creEPAC1小鼠Nek7软5-creNek7小鼠西方染色体分析细胞文化或全视距解析NLRP3,cleftdcaspase1,Interleukin-1-betaPKA活动解析

结果:Nek7cDNA提高NLRP3信号蛋白质,但Nek7siRNA抑制视距内延细胞内这些蛋白高插EPAC1和Forskolin都减少了Nek7和NLRP3路径蛋白,即使与Nek7cDNA并发内向细胞消除Nek7

结论:Nek7调控NLRP3体外和体外发炎性蛋白Epac1和PKA都位于Nek7和NLRP3上游,并可以克服Nek7超值CAMP蛋白可以抑制Nek7和块激活NLRP3炎性蛋白

糖尿病视网膜病是工作年龄成人失明的主要原因很明显,炎症在糖尿病视网膜复元中起着作用。一种潜在的视网膜炎路径即为炎症多粒子脚架综合体,内含NOD相似受体网域成员NLRP、procaspase1和嵌入CARD的potocisi相关插件类蛋白,导致Interleukin-1Beta和IL-18激活 一号 - 3迄今NLRP1和NLRP3都与糖尿病视网膜病理相关 2 , 4脱机多数工作侧重于NLRP3煽动性人体不同阶段的糖尿病工作显示NLRP3增加,并富震样本中相关炎性蛋白质增加,在多发性二乙型视网膜病症患者中观察到最大响应 5 , 6数项研究显示NLRP3在视网膜中起煽动作用,但以NLRP3上游调控者为重点的研究较少
NLRP3炎症可调控的一个潜在路径是NIMA7相关离子体7Nek7通过α和β管状 试管内.Nek7击出细胞显示 Al-tubulin封存增加 7其他人报告Nek7对NLRP3调控NLRP3 8其他人则确认Nek7为NLRP3中关键播放器使用全基因组CRISP屏幕大字组启动 九九最近的一项研究将Nek7和NLRP3连接到高甘蔗生长的视距内分贝细胞中 10
当前的研究旨在探索Nek7上游调节及其作用激活NLRP3路径蛋白交换蛋白质CAMP1(EPAC1) 11很可能通过EPAC1中间抑制NLRP3 12最近研究显示二二强感应器沙美特洛抑制NLRP3初级骨髓-衍生宏图炎 13EPAC1和蛋白状A受体激活受管PKA行动有限文献NLRP3煽动性
研究的目的是扩展张等公司的工作 10深入调查Nek7启动NLRP3使用Nek7cDNA和Nek7小干扰RNA以抑制NLRP3炎热路径
方法论
鼠标
EPAC1单词细胞-单击Mice
EPAC1浮鼠B6;129S2Rapgef3 m1Geno/J小鼠)和B6.FVB-Tg(Cdh5-cre)7Mlia/JCre小鼠从Jackson实验室购买(Bar港、ME、USA)。一代代后Epat1软鼠与Cdh5-cre小鼠相生,生成条件击鼠Epace1 112个月大时 Epac1浮点数和Epac1Cre-Lox小鼠被用来采集视网膜样本
Nek7鼠标
Nek7浮小鼠与Cdh5-cre小鼠B6.FVB-Tg(Cdh5-cre)7Mlia/J相隔两代后,我们为Nek7执行基因构造学和免疫学,像我们为鼠标其他聚居区所做的那样 11
网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际网际
基因组式脱氧核糖核酸取自2周老鼠耳膜样本耳拳用单步尾脱氧缓冲消化(100-mMTIS5mEDTA200mMNACl,1%TritonX-100加蛋白酶K(10 mg/ml)素数双用于筛选Nek7条件击鼠如下:
  • ·Nek75Q3Q5Q3Q变异反转CTGGAGAGAGGGG
  • ·Cdh5-cre5Q3Q5+3+5TGTGCATCGAGGTA
KAPA2G热StartGenypingPCRMix三十五轮95摄氏20秒60摄氏度45秒,72摄氏度最后一次扩展1分钟
Nek7名名词算法
3个月的Nek7浮点数和Nek7Cdh5-cre小鼠用CO 2后宫颈错位证实死亡后,双眼取出并插入PBS4%假冒药2小时整球转0.1-MPBS分解视网膜视网膜浸泡PBS并置入5%正常山羊血清2小时室温阻塞非专用染色Abcam剑桥市和GS-IB4与Alexa Fluor488相联(1:500!ivrogen,Waltham,MA,USA)2天4摄氏度Triton X-100/PBS0.3%冲刷后,视网膜与二级抗体山羊反兔并发后4摄氏4度通宵555(1:1000/LifeTechnology,Carlsbad,CA,USA)样本完全安装并用组合显微镜检验(Leica,Wetzlar,德国)。
所有动物程序均符合ARVO词学和视觉研究使用动物声明,经Wayne州立大学机构动物护理使用委员会批准并符合国家卫生院准则上头 表2描述鼠标工作
表态
视图表
实验转基因Mice
表态
实验转基因Mice
实验转基因Mice
视网膜直发细胞
初级人类RECs从细胞系统购买(Kirkland、WA、USA)。细胞系统介质(5-mmg/mlggycin和0.25mg/mlaphtericin B部分盘菜移高甘蔗介质(25mm手机系统实验仅在第6段前使用单元格细胞在实验使用前24小时注入高或普通甘蔗介质而无微血管生长因子
细胞处理
两种甘蔗条件中的一些细胞用Nek7cDNA移植 14取自TermoFishScience,Waltham,MA,USA)或空向量使用亲脂两种条件中的其他细胞均由Nek7siRNA转包(Dharmacon/Horizon发现y,Lafayette,CO,USA)或rapsedsiRNADharmacon/Horizon发现)GenMute系统(SignaGen实验室,Frederick公司,MD公司,USA公司)按制造商指令实现移植,正如我们先前所做的那样 15部分细胞与Nek7cDNA转接后用EpAC1求效器处理(Tocris生物科学公司,Avon,UK) 112小时10M取Nek7cDNA转接其他细胞并发Forskolin处理Tocris生物科学)
西布洛丁
REC或全视距解析器收集入解析缓冲器-含蛋白质和磷素抑制器等量蛋白加载并分离成预播 三维Glycine gels(Invitrogen)并粘贴到硝化细胞膜上mbranes封装10xTris缓冲盐水20150mNACL0.1%Tween20和5%BSA并用相应的主抗体EPAC1、IL-1BET、NLRP3和Nek7Cleftd Caspase1(ell信号技术公司丹佛公司、MA公司、USA公司)和Bea-actin (themFisher科学,Waltham,MA,USA)布洛特用二级抗体孵化反生物综合体使用化学试剂包识别(热渔科),图像使用C500评估(Azure生物系统,都柏林,CA,USA)。图片Studiolite软件用于测量频带密度
PKA活动解析
PKAELISA(Enzo生命科学公司,Ann Arbor公司,美国)根据制造商指令对蛋白液进行测试,但抗体反应4摄氏度隔夜
统计学
Prism6.0(GraphPad,Santiego,CA,USA)用于统计分析单向ANOVA图基后期测试用于分析工作鼠类 无依无靠 t级测试使用 P级< 0.05被认为重要提供代表色素西线数据
结果
Nek7cdNA规范NLRP3
前文工作显示Nek7规范NLRP3宏图炎 8 , 14高甘蔗激活NLRP3 12研究中,我们试图确定Nek7是否为RECsNLRP3炎症关键高甘蔗增加NLRP3路径蛋白Nek7cdNA用于刺激Nek7动作 图1B到 一号D显示Nek7进一步提高NLRP3,caspase1和IL-1et蛋白 图1A控件显示Nek7cDNA成功转入REC
图1
Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量确定Nek7cDNA移植成功Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量高山市 A级)确认Nek7cDNA移植成功高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
图1
Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量高山市 A级)确认Nek7cDNA移植成功高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量确定Nek7cDNA移植成功Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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Nek7siRNA块NLRP3
支持RECsNek7cDNA数据,我们将Nek7siRNA或siRNA分解入RECs以确定Nek7抑制是否防止高插值-诱发NLRP3路径蛋白 图2B到 2D显示高甘蔗增加NLRP3阻塞信号Nek7siRNA转入RECs、NLRP3、cleepd caspase1和IL-1BET水平都比高甘蓝单片大幅下降 图2A控件显示SiRNA移植成功击倒Nek7
图2
Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA(A)确认Nek7siRNA成功击倒Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM
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Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA高山市 A级)确认Nek7siRNA成功击倒高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM N级=6
图2
Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA高山市 A级)确认Nek7siRNA成功击倒高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM N级=6
Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA(A)确认Nek7siRNA成功击倒Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM
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EPAC1规范Nek7级
Epac1减少视网膜煽动性调解员 11研究中,我们想判断EPAC1是否减少Nek7动作EPAC1浮接和内接小鼠测量Nek7水平视网膜解析器提高Nek7水平 图3A).支持动物发现,我们用EPAC1求效器处理RECs并发现Agyist显著下降Nek7水平,而Nek7高葡萄糖水平(Nek7)(Nek7)比较 图3)这些数据显示EPAC1规范Nek7
图3
EPAC1规范Nek7Epac1浮化和Cdh5-cre-Epace1小鼠Epace1Cre-LoxP < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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EPAC1规范Nek7西方线性解析结果EPAC1浮化和Cdh5-cre-EPAC1小鼠EPAC1Cre-Lox A级和RECs以正常甘蔗生长5mm或高甘蔗生长25mm B级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=5
图3
EPAC1规范Nek7西方线性解析结果EPAC1浮化和Cdh5-cre-EPAC1小鼠EPAC1Cre-Lox A级和RECs以正常甘蔗生长5mm或高甘蔗生长25mm B级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=5
EPAC1规范Nek7Epac1浮化和Cdh5-cre-Epace1小鼠Epace1Cre-LoxP < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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EPAC1克服Nek7cDNA对NLRP3
测试Epace1上游Nek7改变NLRP3路径蛋白质,我们用EPAC1或Nek7cDNA或两者处理RECs 图4显示高甘蔗增加NLRP3炎性蛋白Nek7cdNA支持显示工作 图1.EPAC1单能减少NLRP3 图4A),criftdcaspase1 图4B类和IL-1B类 图4C)RECsEpac1跟踪Nek7cDNA转接时,与Nek7cDNA相比显著下降这些数据显示Epace1通过NLRP3信号交换提高Nek7
图4
EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA(A-D)Westblot结果NLRP3(A)、Caspase1(B)、IL-1B和Nek7(D)。P < 0.05对正常葡萄糖#P < 0.05对高葡萄糖$P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA高山市 A级- D级西波结果NLRP3 A级sapase1 B级il-1et C级和Nek7 D级) * P级< 0.05对正常甘蔗 ## P级< 0.05对高葡萄糖; 美联储 P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
图4
EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA高山市 A级- D级西波结果NLRP3 A级sapase1 B级il-1et C级和Nek7 D级) * P级< 0.05对正常甘蔗 ## P级< 0.05对高葡萄糖; 美联储 P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA(A-D)Westblot结果NLRP3(A)、Caspase1(B)、IL-1B和Nek7(D)。P < 0.05对正常葡萄糖#P < 0.05对高葡萄糖$P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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Forskolin约束Nek7
EPAC1和PKA均受CAMP监管,我们试图确定PKA是否受Nek7监管 图5显示Forskolin有效提高RECs高甘蔗活度 图5B证明Forskolin降低高甘蔗-Nek7诱发增加
图5
Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA(A)和Westernblot(B)数据Nek7P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA A级和西染色 B级RECs中Nek7数据以正常甘蓝生长(5mm或高甘蓝生长(25mm)并用forskolin处理 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
图5
Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA A级和西染色 B级RECs中Nek7数据以正常甘蓝生长(5mm或高甘蓝生长(25mm)并用forskolin处理 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA(A)和Westernblot(B)数据Nek7P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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Forskolin用Nek7cDNA减少NLRP3动作
类似EPAC1,我们处理REC单面向skolin,Nek7cDNA单面向或组合 图6高浮点增加Nek7/NLRP3路径蛋白质NLRP3蛋白质的增加因Nek7cDNA转包而得到进一步的增强Forskolin处理减少了所有NLRP3蛋白Forskolin破解Nek7cDNA移植以减少RECs中NLRP3路径蛋白 图6表示PKA规范Nek7NLRP3阻塞信号
图6
Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin控件显示Forskolin增加PKA活动西方烟雾结果NLRP3(B)、caspase1(C)、IL-1BE(D)和Nek7(E)。P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA$P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin高山市 A级控件显示forskolin增加PKA活动高山市 B级- E级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级il-1et D级和Nek7 E级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA 美联储 P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
图6
Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin高山市 A级控件显示forskolin增加PKA活动高山市 B级- E级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级il-1et D级和Nek7 E级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA 美联储 P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin控件显示Forskolin增加PKA活动西方烟雾结果NLRP3(B)、caspase1(C)、IL-1BE(D)和Nek7(E)。P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA$P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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Nek7内向细胞验证-特异击出Mice
数据表明Nek7参与监管RECsNLRP3炎性蛋白深入测试,我们生成Nek7小鼠,Nek7用Nek7软鼠与Cdh5-cre小鼠交叉消除内接合细胞 图7展示小鼠基因组 图7B显示免疫敏锐显示视波变异学Nek7缺失
图7
验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞评分结果B) 光学显示消除视网膜插件中的Nek7测序结果n=8光值工作n=5
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验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞高山市 A级归结结果高山市 B级显出视网膜电流消除Nek7测序结果 N级8防光工作 N级=5
图7
验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞高山市 A级归结结果高山市 B级显出视网膜电流消除Nek7测序结果 N级8防光工作 N级=5
验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞评分结果B) 光学显示消除视网膜插件中的Nek7测序结果n=8光值工作n=5
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Nek7Mice标记异漫
内卡7损耗 流体变换NLRP3信号 图8显示Nek7损失显著减少NLRP3 图8B类,criftdcaspase1 图8C)和IL-1BE 图8完全视网膜解析Nek7浮化和Nek7Cdh5-cre小鼠
图8
Nek7规范NLRP3Nek7或Cdh5-cre-Nek7小鼠(Nek7Cre-Lox)用全视素解析测量Nek7(A)、NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1DP < 0.05vs浮鼠数据平均++SEM
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Nek7规范NLRP3Nek7浮化或Cdh5-cre-Nek7鼠标全视素解析 A级NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级)层次 * P级< 0.05 vs浮鼠数据平均++SEM N级=5
图8
Nek7规范NLRP3Nek7浮化或Cdh5-cre-Nek7鼠标全视素解析 A级NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级)层次 * P级< 0.05 vs浮鼠数据平均++SEM N级=5
Nek7规范NLRP3Nek7或Cdh5-cre-Nek7小鼠(Nek7Cre-Lox)用全视素解析测量Nek7(A)、NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1DP < 0.05vs浮鼠数据平均++SEM
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EPAC1和PKA都规范Nek7和NLRP3路径蛋白减少视网膜炎 图9图表基础这些研究结果显示EPAC1和PKA都可降低Nek7水平,导致NLRP3路径蛋白质严重抑制
图9
PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
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PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
图9
PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
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讨论
前文显示视网膜血管内有NLRP3路径蛋白 12在这次研究中,我们推广这些发现显示高甘蔗增加NLRP3信号性RECs蛋白发现与视网膜上皮细胞显示NLRP3增生和炎性蛋白 16在当前研究中,我们还复制了张等人研究的结果 10并显示Nek7siRNA阻塞RECsNLRP3蛋白接二连三推展张等 10Nek7cDNA移植证明Nek7cDNA提高REC高甘蔗生长中NLRP3路径蛋白
因为我们曾显示EPAC1规范NLRP3炎性蛋白 12确定EPAC1是否需要Nek7 图3EPAC1规范Nek7此外,由于EPAC1和PKA均取自caMP路径,我们选择探索Forskolin是否规范Nek7数据显示Forskolin用高甘蔗生长的RECs所有NLRP3炎性蛋白综合这些发现证明EPAC1和PKA都位于Nek7上游并可能抑制NLRP3炎性蛋白测试Nek7对NLRP3的监管效果鼠标显示Nek7在视网膜变换中消除时,我们用这些鼠标来证明Nek7在单直通性细胞中减值足以减少NLRP3全视网膜解析中信号蛋白
数据匹配文献ARPE-19细胞研究证明抗炎和抗氧化grelin有效减少NLRP3信号 17其他人最近显示MCC950NLRP3抑制器能够减少NLRP3二维小鼠信号作用,包括减少糖尿病诱发渗透性变化 18号因此,我们在NLRP3中信号RECs匹配现有文献据我们所知,我们是第一批报告EPAC1和PKANek7调控机制,作为减少NLRP3信号机制前文显示EPAC1减少NLRP3信号 12但我们选择集中研究Nek7上游规范基于NLRP3现有文献在其他目标中煽动性,高移动类框1和收费式受体4 19号EPAC1和PKA都抑制TRR4和HMGB1在RECs的行动 15 , 20码 - 22号EPAC1可减少活性氧种类,这也是激活NLRP3炎症的关键 23号EPAC1和PKA似通过防炎或抗氧化作用阻塞Nek7并测试这些机制将是未来工作的重点
未来研究包括使Nek7小鼠二维研究糖尿病是否加剧NLRP3阻塞Nek7/NLRP3的潜在阻塞路径和阻塞Nek7/NLRP3未来工作还将调查HMGB1和TLR4抑制是否为EPAC1和PKA和Nek7行动提供NLRP3煽动性联系并关注NLRP3煽动性生理行为支持蛋白质工作
结论
我们的调查结果与张等人的调查结果一致 10并显示Nek7siRNA减少NLRP3信号后用Nek7cDNA图集扩展体外研究证明CAMP路径块Nek7/NLRP3信号生成Nek7内接合细胞内向细胞损耗Nek7全视距解析分解NLRP3信号蛋白这些数据显示Nek7调控视波体中NLRP3信号蛋白EPAC1和PKA禁止Nek7阻塞NLRP3信号
感知感知
作者感谢元河提供Nek7cDNA标本和BennyMotro博士向元河提供Nek7软鼠
国家眼科学院国家卫生学院提供赠款支持(R01EY-0028442转JJSR01EY-030284和P30EY-04068LDH)和不受限制地研究预防盲目赠款
披露: L.刘义无; Y.江市无; J.J.斯坦立尔,无
引用
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图1
Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量确定Nek7cDNA移植成功Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量高山市 A级)确认Nek7cDNA移植成功高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
图1
Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量高山市 A级)确认Nek7cDNA移植成功高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
Nek7cdNA规范NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7cDNA或空向量确定Nek7cDNA移植成功Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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图2
Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA(A)确认Nek7siRNA成功击倒Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM
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Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA高山市 A级)确认Nek7siRNA成功击倒高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM N级=6
图2
Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA高山市 A级)确认Nek7siRNA成功击倒高山市 B级- D级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级蛋白质水平 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM N级=6
Nek7siRNA调控NLRP3信号RECs以正常甘蔗5m或高甘蔗25m传播Nek7siRNA或rapsdsiRNA(A)确认Nek7siRNA成功击倒Westblot结果NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1BI蛋白P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7siRNA数据平均++SEM
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图3
EPAC1规范Nek7Epac1浮化和Cdh5-cre-Epace1小鼠Epace1Cre-LoxP < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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EPAC1规范Nek7西方线性解析结果EPAC1浮化和Cdh5-cre-EPAC1小鼠EPAC1Cre-Lox A级和RECs以正常甘蔗生长5mm或高甘蔗生长25mm B级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=5
图3
EPAC1规范Nek7西方线性解析结果EPAC1浮化和Cdh5-cre-EPAC1小鼠EPAC1Cre-Lox A级和RECs以正常甘蔗生长5mm或高甘蔗生长25mm B级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=5
EPAC1规范Nek7Epac1浮化和Cdh5-cre-Epace1小鼠Epace1Cre-LoxP < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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图4
EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA(A-D)Westblot结果NLRP3(A)、Caspase1(B)、IL-1B和Nek7(D)。P < 0.05对正常葡萄糖#P < 0.05对高葡萄糖$P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA高山市 A级- D级西波结果NLRP3 A级sapase1 B级il-1et C级和Nek7 D级) * P级< 0.05对正常甘蔗 ## P级< 0.05对高葡萄糖; 美联储 P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
图4
EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA高山市 A级- D级西波结果NLRP3 A级sapase1 B级il-1et C级和Nek7 D级) * P级< 0.05对正常甘蔗 ## P级< 0.05对高葡萄糖; 美联储 P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM N级=6
EPAC1通过Nek7减少了NLRP3路径RECs以正常甘蔗5mm或高甘蔗25m处理Nek7cDNA或Nek7cDNA(A-D)Westblot结果NLRP3(A)、Caspase1(B)、IL-1B和Nek7(D)。P < 0.05对正常葡萄糖#P < 0.05对高葡萄糖$P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA数据平均++SEM
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图5
Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA(A)和Westernblot(B)数据Nek7P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA A级和西染色 B级RECs中Nek7数据以正常甘蓝生长(5mm或高甘蓝生长(25mm)并用forskolin处理 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
图5
Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA A级和西染色 B级RECs中Nek7数据以正常甘蓝生长(5mm或高甘蓝生长(25mm)并用forskolin处理 * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
Forskolin监管Nek7PKA活动ELISA(A)和Westernblot(B)数据Nek7P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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图6
Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin控件显示Forskolin增加PKA活动西方烟雾结果NLRP3(B)、caspase1(C)、IL-1BE(D)和Nek7(E)。P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA$P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin高山市 A级控件显示forskolin增加PKA活动高山市 B级- E级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级il-1et D级和Nek7 E级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA 美联储 P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
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Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin高山市 A级控件显示forskolin增加PKA活动高山市 B级- E级西波结果NLRP3 B级sapase1 C级il-1et D级和Nek7 E级) * P级< 0.05对正常甘蔗; ## P级< 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA 美联储 P级< 0.05对高葡萄糖数据平均++SEM N级=6
Forskolin通过Nek7减少NLRP3RECs正常甘蔗5mm或高甘蔗25mm处理Nek7cDNA或Nek7cDNA+skolin控件显示Forskolin增加PKA活动西方烟雾结果NLRP3(B)、caspase1(C)、IL-1BE(D)和Nek7(E)。P < 0.05对范甘茄P < 0.05对高甘蔗+Nek7cDNA$P < 0.05对高甘蔗数据平均++SEM
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图7
验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞评分结果B) 光学显示消除视网膜插件中的Nek7测序结果n=8光值工作n=5
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验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞高山市 A级归结结果高山市 B级显出视网膜电流消除Nek7测序结果 N级8防光工作 N级=5
图7
验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞高山市 A级归结结果高山市 B级显出视网膜电流消除Nek7测序结果 N级8防光工作 N级=5
验证Nek7鼠Nek7浮小鼠用Cdh5-cre小鼠培育消除Nek7内接合细胞评分结果B) 光学显示消除视网膜插件中的Nek7测序结果n=8光值工作n=5
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图8
Nek7规范NLRP3Nek7或Cdh5-cre-Nek7小鼠(Nek7Cre-Lox)用全视素解析测量Nek7(A)、NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1DP < 0.05vs浮鼠数据平均++SEM
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Nek7规范NLRP3Nek7浮化或Cdh5-cre-Nek7鼠标全视素解析 A级NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级)层次 * P级< 0.05 vs浮鼠数据平均++SEM N级=5
图8
Nek7规范NLRP3Nek7浮化或Cdh5-cre-Nek7鼠标全视素解析 A级NLRP3 B级sapase1 C级IL-1BI D级)层次 * P级< 0.05 vs浮鼠数据平均++SEM N级=5
Nek7规范NLRP3Nek7或Cdh5-cre-Nek7小鼠(Nek7Cre-Lox)用全视素解析测量Nek7(A)、NLRP3(B)、caspase1(C)和IL-1DP < 0.05vs浮鼠数据平均++SEM
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图9
PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
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PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
图9
PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
PKA和EPAC1调控Nek7NLRP3信号蛋白图表描述PKA和EPAC1信号路径Nek7和NLRP3信号蛋白减少视网膜炎
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