2021年7月
卷629
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视网膜 2021年7月
激活血凝因子X(FXa)通过推介RPEEEpitherial-Mesenchymal过渡促进外文PVR开发
汉汉 ; 小化 ; 孟圭辽 ; 英宁宋 ; 台云你 ; 学东 ; 雪利杨 ; 王小红 ; 宝黄 ; 美度 ; 华燕市
作者关联注解
  • 汉汉
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
  • 小化
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
  • 孟圭辽
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
  • 英宁宋
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
  • 台云你
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
  • 学东
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
    分子脉冲学实验室药理学系和天津关键实验点点火生物科基础医学学院天津医科大学中国天津
  • 雪利杨
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
    海洋学系中国云南达利大学第一附属医院
  • 王小红
    分子脉冲学实验室药理学系和天津关键实验点点火生物科基础医学学院天津医科大学中国天津
  • 宝黄
    美国密西西比州Jackson密西西比大学医学中心Ophalmolog
  • 美度
    分子脉冲学实验室药理学系和天津关键实验点点火生物科基础医学学院天津医科大学中国天津
  • 华燕市
    天津大学总医院Ophalmlogy系,中国天津
  • 通讯:华燕市天津大学总医院154安山路 天津30052 zyyyanhua@tmu.edu.cn.
  • 美度医科大学Qixiangtai路22号中国天津300070 dumei@tmu.edu.cn
  • 脚注
    HH和XZ对这里介绍的工作贡献平等,因此应被视为等效写作者
视觉科学调查 2021年7月 Vol.62 29多伊:https://doi.org/10.1167/iovs.62.9.29
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      激活血凝因子X(FXa)通过推介RPEEEpitherial-Mesenchymal过渡促进外文PVR开发
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      汉宋激活血凝因子X(FXa)通过推介RPEEEpitherial-Mesenchymal过渡促进外文PVR开发投资公司Ophthalmol大学维斯科学文献2021;62(9):29多伊:https://doi.org/10.1167/iovs.62.9.29.

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      ARVO(1962-2015)作者群(2016-present)

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抽象性

目标:非受控卷积反应有助于数个器官的病理纤维扩散,但它们在增生电磁共振作用仍有待解析在这次研究中,我们评价FXa在RPE细胞和鼠标PVR模型中的分解效果

方法论:外伤PVR病人眼中的FXa水平和机器眼部创伤兔子模型由ELISA和免疫心理学测量FXa诱发RPEEMT通过检验细胞扩散、迁移、紧接点变化和纤维标记表达方式进行评估面向维沃研究FXa注入失眠眼部,然后用语法分析评价内部纤维化和西方染色PVR鼠标模型还检验FXa抑制器的治疗效果

结果:VitreousFXa创伤性PVR患者比肌肉洞患者高FXa和PAR1表达式从创伤PVR病人的上膜中发现维特鲁斯FXa在兔子机械眼部外伤后明显增加内试管FXa刺激RPEEMT特征为ZO-1中断、分解细胞极化并增加直白表达式共注入FXa并分解小鼠引致更严重损耗视像结构,并增加EA-SMA表达式比FXa或分解处理单口服FXa或trombin抑制器在PVR鼠标模型中严重阻塞内部纤维化FXa推介ARPE19细胞p38激活此外,TGF-BER抑制器还显著减轻小鼠FXa诱发的内核纤维化

结论:FXa通过RPE激活机制促进小鼠内部纤维化

增生电磁感应术威胁视觉复元机械眼部创伤,40%至60%受开球伤害的病人发生这种复元 一号PVR开发下的关键细胞事件是视网膜断裂后视网膜迁移扩散问题,视网膜进一步加入前后区缩膜编组工作,当ERM合同并引起视网膜破损时,视觉损耗就会发生。PVR当前处理选项为振荡式外科清除纤维组织并修复视网膜分治 2 - 4尽管外科技术最近有所改进,58.9%的PVR病人由于常量分治而视觉诊断不良 5因此迫切需要新的预防和治疗PVR策略。
PVR内ERM生成的精确机制不完全理解,视网膜上皮细胞是ERP中发现的主要细胞类型 6视网膜伤害期间,RPE单层中断,离散RPE细胞释放入体腔或子膜空间,并在那里经历上下膜对子膜切换(EMT)切入近似ibroblast细胞 7 , 8RPEEMT可以通过接触多细胞素数和生长因子来初始化,例如TGF-Di 九九 , 10相容因子除作用于凝解血液外,还产生分解分解效果和分解效果 11 , 12
活性因子Xxa系串行关键蛋白质 13最近的研究表明FXa在不同器官系统包括肺部、肝脏和肾脏病理纤维化中起着关键作用。 13 - 15FXa和strombin等相容蛋白质素的分片活动通过激活probet-激活受体PAR1-4进行介导,该受体主要对PAR1-3-4和FXa激活PAR1或2 14前几次研究报告 mRNA表示PAR1和PAR3在RPE细胞中,FXa和Trombin主要通过PAR1对培养RPE细胞中分解分解分解分解效果 11并观察到阵列视网膜分治或PVR 16静态样本可刺激ARPE-19细胞分解和分解响应,建议聚变机内归并因子作用上文提到FXa居中心位置,即内在和外部凝聚路径,催化子宫素转换为strombin抑制与FXa抑制剂相吸可能阻塞随后增量级联前几次研究报告FXa抑制效果比strombin抑制效果强 降低鼠标肝纤维化速率 17表示早先抑制凝聚级联 是一个有希望治疗Fibrotical疾病
至今为止,没有任何研究调查 维沃FXa对PVR开发的影响和FXa在视觉外伤后生成ERC时的临床关联性未知研究中,我们检视受创PVR人眼中的FXa表达方式和机械眼外科后兔子眼中的FXa表达方式FXa对ARPE-19细胞ERPEEMT的效应和机制注入FXA除尘器 一种已知诱导小鼠PVR相似条件的代理 18号深入检测FXa 维沃并调查FXa信号抑制的治疗潜力
材料方法
聚用PVR膜和维特鲁斯
人类光机膜和光机外科从天津医科总医院创伤光机病人处获取所有程序均按机构指南执行,所有病人都提交了书面知情同意表。薄膜固定为4%伪药30分钟,4摄氏度通宵脱水松软嵌入OCT复合体后,薄膜隔开20微米并存储到-8摄氏度直至分析受血液污染的活性样本排除FXa和TGF-DI测试人FXaELISA包mlbio,上海中国)和TGF-ETELISA工具箱
rabit眼外伤模型
兔子处理成视觉和眼科动物语句研究协会并保存在天津矫形研究所实验动物实验室兔子开球伤害模型5毫米平行横向切片6.0毫米兔子闭球伤害模型使用液击伤装置简单制作,锤子定角为65摄氏度,然后角角中心兔右眼中曾中弹受创后,约0.1ml虚流水提取指定时点,静流水提取单兔仅一次FXa浓度用ELISA工具箱测量(DEIA-BJ2660!创用诊断学,雪莉NC,USA
鼠标PVR模型
天津医科大学动物道德委员会批准所有动物并加入视觉和phallogy动物报表研究协会雄性C57Bl/6J鼠用Oxiprocaine氢化物作iris二变法和troapide后用10%氯水合物麻醉内向注入使用10微升汉密顿针头和33G针头控制鼠接受1微L2%BSA,实验鼠一次性注入分解或FXaRivaroxaban(Bayer,德国,1 mg/g饮食)和daigatran(BehringerIngelheiTGF-Be抑制处理方法,小鼠每日腹部注入10 mg/kgLY2109761(HY12075!MedChemExpress,Monmouth交叉处理,NJ,USA)连续14天即时启动十四天后,Fundus图像和光一致性摄影使用视微成像系统(Phoenix研究实验室,Pleasanton,CA,USA)双眼剖析广度PVR基于前一研究分级 19号分级标准详解 补充表S1.
细胞文化
人类RPE细胞线ARPE-19细胞编译介质DMEM/F12介质内含10%胎儿牛血清(均取自Gibco, ThermoFish科学,Waltham,MA,USA) 2文化媒体隔天变换面向 试管内实验中,细胞饿死无血清介质(SFM)
细胞可容性
ARPE-19细胞用96行盘播种,密度为1x10 4细胞/井接触FXa24小时后,手机可行性由Cell计数KT-8解析判定(CCK-8!Dojindo分子技术公司,Kumamoto,日本)根据制造商指令简言之,10微升CCK8解析法加到每口井中并分三十七摄氏分二小时注入,然后用分光计测量450纳米吸附法每一次实验都用五叉井进行,并进行了三次独立实验
小插管RNA
人类PAR1小干扰RNAs从Genepharma(中国上海)获取击倒实验实验是根据厂商协议进行的ARPE-19细胞培养70%并发后使用160nMPAR1siRNA转包细胞嵌入SIRNA12小时后返回正常培养介质实验在移植后48小时内进行
西布洛特
ARPE-19细胞或鼠视网膜在RIPA缓冲区解析30分钟冰面液化机四摄氏二万二千分总蛋白浓度由BCA解析量化(Solarbio,LifeScience)。等量蛋白由dodegylulfate-polyacli膜隔夜4摄氏度向主抗体孵化布洛特用自动染色分析系统检测到(Milipore,Burlington,MA,USA)。使用imageJ软件量化blots
Immunohistochemistry
ARPE-19细胞由12well板块封印播种处理后,4%PFA固定15分钟并阻塞0.3%TritonX-100和2%BSAPBS一小时洗完后,细胞在4摄氏度湿室夜间用主抗体孵化,后再用二级抗体孵化一小时封片用组合显微镜检查(Zeiss LSM510济斯市Oberkochen市
鼠眼收集并修复4%PFA一小时角形镜片取出后,RPE类roid-sclera综合体从神经视网膜剥离RPE整数与1%Triton X-100/PBS相容并阻塞4摄氏度时5%山羊血清整片用主抗体孵化两天 4摄氏度清洗后,RPE整流带二级抗体和prodiumidi西格玛-阿尔德里希公司StLouis,MO,USA)两个小时RPE整片用组合显微镜检验
transwell解析
ARPE-19细胞在上机24行遍历板中播种(Cortning公司康宁公司,NY美国),100微LDEM/F12介质含0.5%FBS下包厢填充600微LDEM/F12介质,含10%FBS细胞用FXa或TGF-BA2处理8小时,然后清除滤波上层的细胞,过滤器下面迁移细胞用4%PFA固定并染色0.1%晶紫30分钟图像用荧光显微镜摄取(Olympus公司,东京,日本),迁移细胞使用imageJ软件计数5随机字段迁移单元格数(放大x10)计算
scratch解析
分析细胞迁移时,ARPE-19细胞用六井盘播种,密度为1x10 5细胞/井RPE单层用20微升管道处理伤口后,细胞处理并用光显微镜摄取图像(OlympusCorporation)零时24小时抓取RPE迁移百分比使用imageJ软件分析3个字段(放大x10)对3项独立实验的每种处理均量化
分析细胞极性时,ARPE-19细胞用12well板播种并配有玻璃封页细胞抓取并用不同的代理处理24小时取4%PFA固定15分钟并隔夜4°C加注反GM130,再加插FITC相容二级抗体一小时洗完后,盖页与DAPI对接并可视化综合显微镜(ZeissLSM800Zeiss)
BrdU解析
ARPE-19细胞播种12well板覆盖细胞处理后brdUsigma-Aldrich)添加并注入三十七摄氏度四小时取4%PFA/PBS20分钟并阻塞2%BSA0.3%Triton X-100/PBS30分钟反gen解压缩工作方式是加冰20分钟0.1MHCL2MHCL30分钟后加中值15分钟洗完后,盖页加反BrdUAbcam剑桥市MA美国分校)4摄氏度通宵并用二级抗体孵化一小时覆盖页用DAPI反联想显微镜(ZeisLSM800Zeiss)3项独立实验的视图至少3字段(放大x40)量化
统计分析
所有研究都显示为平均++SEM数据分析使用 t级测试或单向ANOVAP < 0.05计算重大差分所有统计分析均使用Prism软件进行(GraphPad、Santiego、CA、USA)。
结果
FXa常量增加
探索FXa与创伤PVR的关系,我们检测到FXa从PVR患者收集的ERC表达方式,由创伤和非创伤诱导(RD病人与PVR相混淆)通过免疫保存发现FXa表达式与AL-SMA阳性细胞合用 补充FigS1FXa表达法在机构风险管理中比非创伤(TPVR)更显眼 金字塔一号A级 一号)探索FXa是否定位为RPE细胞,我们用RPE标识FXa和RPE65执行双重染色发现FXa荧光信号大都与RPE65合用 金字塔一号A级 一号)外伤PVR病人体液样本中的FXa水平比macle洞病人大增(MH)(MH) 微博一号C)级FXa透视外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科外科OGI后,VitreousFXa0.5天大增3天峰值并稳定下降OGI控件组间VitreousFXa意义在受伤后7天减值 微博一号D).闭球伤害后,VitreousFXa增加并达0.5天峰值,然后略微下降,但水平保持高位,创28天后(创28天后)( 微博一号E.)总的来说,这些数据显示受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤FXa增富水平,创伤PVR病人表示FXa
图1
受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高代表组合FXA和RPE65免疫从TPVR病人和PVR病人分离出膜量化FXa染色C)富士氏度远高于macle洞ELISA测量兔子模型开球伤害ELISA测量兔子模型闭合地球损耗n=5动物/时点数据显示为平均++SEM,*P < 0.05**P < 0.01!***P < 0.001
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受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高高山市 A级FXa和RPE65与TPVR病人和PVR病人隔离膜内免疫合影高山市 B级量化FXa染色高山市 C级富士氏丰度远高于macle洞高山市 D级ELISA测量兔子模型开球伤害高山市 E级ELISA测量兔子模型闭合地球伤害n=5动物/时点数据显示为平均++SEM P级< 0.05!网际网际网际网路 P级< 0.01!*** P级< 0.001.
图1
受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高高山市 A级FXa和RPE65与TPVR病人和PVR病人隔离膜内免疫合影高山市 B级量化FXa染色高山市 C级富士氏丰度远高于macle洞高山市 D级ELISA测量兔子模型开球伤害高山市 E级ELISA测量兔子模型闭合地球伤害n=5动物/时点数据显示为平均++SEM P级< 0.05!网际网际网际网路 P级< 0.01!*** P级< 0.001.
受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高代表组合FXA和RPE65免疫从TPVR病人和PVR病人分离出膜量化FXa染色C)富士氏度远高于macle洞ELISA测量兔子模型开球伤害ELISA测量兔子模型闭合地球损耗n=5动物/时点数据显示为平均++SEM,*P < 0.05**P < 0.01!***P < 0.001
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FXa损耗ERP细胞交叉点和分位极度并推广RPE细胞扩散和迁移
FXa处理后分析RPE紧接合点、细胞极度、扩散和迁移RPE细胞TGF-BET2使用为正控件发现FXa处理以依赖剂量方式中断ZO-1ZO-1不连续率量化显示25NMFXa导致RPE细胞ZO-1蛋白质损失25.94%,这类似于10ng/mLTGF-BET2效果(31.83%)(31.83%)( 金字塔2A级 2)
图2
FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控并进行了下列实验:(A)ARPE-19细胞内紧接点蛋白ZO-1代表卷式荧光图片计算ZO-1不连续染色率ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极度细胞极性指数量化e.f.测量RPE细胞扩散brdU解析G)CCK8测试ERP细胞可行性测量24小时FXa或TGF-ET由scrach解析处理后RPE细胞迁移数组RPE细胞迁移区跨行迁移分析ARPE-19用FXa处理8H迁移单元格数通过检查六块随机字段图解量化数据显示为平均++SEMP < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控件,并进行了下列实验:(a) A级代表接合蛋白ZO-1ERPE-19细胞高山市 B级量化不连续染色率ZO-1高山市 C级ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极性高山市 D级细胞极性指数量化高山市 英法)测量RPE细胞扩散brdU解析高山市 G级CCK8测试ERP细胞可行性高山市 H级测量24小时FXa或TGF-ET处理Scratch解析高山市 一数组RPE细胞移位高山市 J大全遍历迁移分析ARPE-19用FXa处理8H高山市 K级移位单元格数通过检查六块随机字段图像量化数据显示为平均++SEM* P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图2
FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控件,并进行了下列实验:(a) A级代表接合蛋白ZO-1ERPE-19细胞高山市 B级量化不连续染色率ZO-1高山市 C级ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极性高山市 D级细胞极性指数量化高山市 英法)测量RPE细胞扩散brdU解析高山市 G级CCK8测试ERP细胞可行性高山市 H级测量24小时FXa或TGF-ET处理Scratch解析高山市 一数组RPE细胞移位高山市 J大全遍历迁移分析ARPE-19用FXa处理8H高山市 K级移位单元格数通过检查六块随机字段图像量化数据显示为平均++SEM* P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控并进行了下列实验:(A)ARPE-19细胞内紧接点蛋白ZO-1代表卷式荧光图片计算ZO-1不连续染色率ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极度细胞极性指数量化e.f.测量RPE细胞扩散brdU解析G)CCK8测试ERP细胞可行性测量24小时FXa或TGF-ET由scrach解析处理后RPE细胞迁移数组RPE细胞迁移区跨行迁移分析ARPE-19用FXa处理8H迁移单元格数通过检查六块随机字段图解量化数据显示为平均++SEMP < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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RPE极度损失是EMT期间发生的另一个细胞变化 20码检验细胞极度变化时,我们标注ARPE-19细胞中GM130(aGolgi标记蛋白)典型地说,细胞向向迁移需要双向排列细胞块状组织中心与Golgi位于细胞前端 21号非处理细胞大都前向Golgi细胞迁移前端,反之,FXa处理细胞向细胞迁移方向随机化(FXa处理细胞迁移方向随机化)( 金字塔2C 2D).极度指数计算前报 22号FXa25nm11.75%处理的细胞比未经处理的细胞(45.67%)下降极性指数表示FXa刺激时损耗RPE极性
下一步,我们评估FXa对RPE细胞扩散和迁移的影响在BrdU集成解析中,我们在ARPE19用FXa处理的细胞中发现BrdU+显性增加,高富集FXa(25NM)显示更多BrdU+ 金字塔2E 2F.)类似地,CCK8分析显示FXa诱导的ERP细胞依赖剂量性提高 微博2G.)Scratch解析显示24小时后FXa增加RPE细胞向伤口区迁移 金字塔2H 2I)遍历水系统迁移细胞在FXa启发下大幅增加,50NMFXa显示最强效果 金字塔2J 2K.)
FXa推广矩阵嵌入光机单元格和鼠标模型
确定FXa对ECM沉降效果分析主要矩阵组件Fibronectin表达式发现FNmRNA在FXa处理24H后大增 微博3A).FXa处理后FN蛋白质水平显著提高(25NM)24小时以上48小时 金字塔3B 3C)级响应FXa启发作用FN确认增加RPE细胞FN表达式 金字塔3D 3E.)
图3
FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降a) 检测ARPE-19细胞中的FNmRNA表达式-qRT-PCR处理FXa或TGF-ETFN,fronectinERPE-19用FXa处理(25NM)或TGF-B2测量FN10ng/mL相对FN表达式量化ARPE-19细胞内FN无线标签24小时使用FXa或TGF-BET2处理Neclei与DAPI染色量化FN染色代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、Dispse(0.02U)、FXa(40NM)或dispase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA逐级分解PVR严重性Hi.西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组J.)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜K.)D显示不连续率ZO-1染色度量化值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降高山市 A级FXa或TGF-ET使用qRT-PCR处理的ARPE-19细胞中FN mRNA表达式检测FN,fronectin高山市 B级Westblot测量ARPE-19细胞FXa(25NM)或TGF-BET210NG/mL高山市 C级相对FN表达式(正规化GAPDH)量化高山市 D级FXa或TGF-BE224小时处理的ERPE-19单元FN隐式标签Neclei与DAPI染色高山市 E级量化FN染色高山市 F级代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、depasese(0.02U)、FXa(40NM)或depase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA高山市 G级逐级分解PVR严重性高山市 HI)西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组高山市 J大全)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜高山市 K级)内显示不连续率ZO-1染色度量化 D级.值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图3
FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降高山市 A级FXa或TGF-ET使用qRT-PCR处理的ARPE-19细胞中FN mRNA表达式检测FN,fronectin高山市 B级Westblot测量ARPE-19细胞FXa(25NM)或TGF-BET210NG/mL高山市 C级相对FN表达式(正规化GAPDH)量化高山市 D级FXa或TGF-BE224小时处理的ERPE-19单元FN隐式标签Neclei与DAPI染色高山市 E级量化FN染色高山市 F级代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、depasese(0.02U)、FXa(40NM)或depase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA高山市 G级逐级分解PVR严重性高山市 HI)西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组高山市 J大全)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜高山市 K级)内显示不连续率ZO-1染色度量化 D级.值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降a) 检测ARPE-19细胞中的FNmRNA表达式-qRT-PCR处理FXa或TGF-ETFN,fronectinERPE-19用FXa处理(25NM)或TGF-B2测量FN10ng/mL相对FN表达式量化ARPE-19细胞内FN无线标签24小时使用FXa或TGF-BET2处理Neclei与DAPI染色量化FN染色代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、Dispse(0.02U)、FXa(40NM)或dispase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA逐级分解PVR严重性Hi.西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组J.)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜K.)D显示不连续率ZO-1染色度量化值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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调查FXa分片效果 维沃使用脱机PVR鼠标模型 23号在这个模型中,内部注入脱机引出PVR相似条件,特征为视网膜分治和视网膜折叠,使RPE细胞暴露为维化组件,已知这些组件预处理条件与PVR开发相关 18号Fundus图像和神学分析显示,视网膜分治分解和分解+FXa-处理双眼,后一显示视网膜结构严重损坏(视网膜结构)。 微博3F.)相比之下,光注入FXa并不会诱导视线结构发生可见变化 微博3F.)OCT图像与这些结果一致,清晰显示视网膜成像分片或分片+FXa 微博3F.)之后我们根据先前报告的分级法评估PVR的严重程度 19号并发现双眼接收dispse+FXa显示比眼睛只接收dis 微博3G.)ERM编译由Masson三叉杆染色进一步评价,正Masson染色在用dispse+FXa和dispase处理的视网膜中显出,但不是光FXa处理 补充FigS2)此外,A+FXa表达式在dispase+FXa组比dispase或FXa单独处理视网膜( 微博3H-I)总的来说,这些数据显示FXa除尘共管鼠标内部纤维化速度显著加速
检验RPE激活时评价RPE上下文完整性虽然RPE色素在所有组别中都完好无损(RPE色素不变)( 补充FigS3并使用FXa联合管理严重加重ZO-1分解 金字塔3J 3K.)同时,A+FXa表达式从脱机或脱机+FXa处理眼睛中增加RPE全表态,Depase+FXa处理眼睛显示最突出表达式 微博3J)这些数据显示FXa对RPE激活的直接作用,这可能促成FXa诱导骨内部纤维化
鼠标PVR模型中口交FXa隐型FXa诱发内分解
继续调查FXa实战作用 维沃Rivaroxaban直接抑制FXa注入小鼠14天后,Rivaroxaban对内部纤维化效果通过语法分析与西方染色来评价阵列对推广RPE炎症和EMT的影响在培养式RPE细胞中已充分报告 11 , 24码 , 25码研究中还加入trombin抑制器digatran比较两个抑制器对PVR开发的影响液相色谱-质谱测量器14天后测量两种抑制器的等离子浓缩Rivaroxaban平均等离子浓缩度为56.96纳克/毫升 补充表S2)
视网膜直截面分析显示,Rivaroxaban处理减轻视网膜结构破坏和视网膜分治分解分解分解和分解+FXa小鼠 微博4A).基于HE染色的PVR强度梯度还显示分片和分片+FXa小鼠接受Rivaroxaban处理的PVR较不严重,而小鼠不接受抗coa 微博4)并发现Rivaroxaban应用在小鼠解析法中大幅减少ALA-SMA蛋白表达式 金字塔4C 4D).驱虫+FXa小鼠Rivaroxaban还大幅降低ATA-SMA水平 金字塔4C 4与rivaroxaban对分解鼠群的影响相比程度较小类似Rivaroxaban效果,Dabigatran处理还减轻视网膜结构破坏和视网膜分治分解分解和分解+FXa小鼠 微博4导致小鼠用dabigatran处理的PVR强度小于那些不接受抗coa 微博4F.)此外,daigatran应用还大大地减少了A-SMA在分片小鼠群中的表达式 金字塔4G 4H)Dagigatran没有显示显著效果减少Dispse+FXa小鼠群中的EA-SMA表达式 金字塔4G 4H)简言之,这些数据支持口服FXa抑制器在改善分片鼠标模型PVR方面起有益作用,未来需要临床研究验证结果
图4
鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化dispse+FXa小鼠带或不带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXAB 基于A的PVR强度分级C)级西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜量化C显示的YA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理digatran达比加特兰光片机强度梯度基于E西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式H.)西方A-SMA蛋白表达式量化GAL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01
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鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化高山市 A级dispse+FXa小鼠带或带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXA高山市 B级逐级分解PVR严重性 A级.高山市 C级)西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜高山市 D级量化A-SMA西方图 C级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组高山市 E级dispse+FXa小鼠带或不带预处理达比加特兰高山市 F级逐级分解PVR严重性 E级.高山市 G级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式高山市 H级)西方A-SMA蛋白表达式量化 G级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01
图4
鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化高山市 A级dispse+FXa小鼠带或带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXA高山市 B级逐级分解PVR严重性 A级.高山市 C级)西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜高山市 D级量化A-SMA西方图 C级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组高山市 E级dispse+FXa小鼠带或不带预处理达比加特兰高山市 F级逐级分解PVR严重性 E级.高山市 G级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式高山市 H级)西方A-SMA蛋白表达式量化 G级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01
鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化dispse+FXa小鼠带或不带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXAB 基于A的PVR强度分级C)级西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜量化C显示的YA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理digatran达比加特兰光片机强度梯度基于E西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式H.)西方A-SMA蛋白表达式量化GAL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01
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FXa推导RPEEMT取决于PAR1和P38信号
拆解FXa诱导RPEEMT机制,我们先检查PAR受体是否由FXa激活受FXa启发后PAR1 mRNA大增,PAR2mRNA不变 金字塔5A级 5)西方Blot显示PAR1细胞强表达式RPE,PAR2蛋白只显示微带 微博5C)级FXa启发提高分片PAR1水平,峰值为10分钟,表示FXa激活PAR1 金字塔5C 5D).并发ERPAR1与Fibrotic标识AL-SMA相联 微博5E)建议PAR1在ERPA编程中发挥作用数项研究显示P38-MAPK信号在PVR病理生成中的中心作用 26 , 27号发现FXa处理从处理后10分钟开始对ARPE-19细胞中的P38进行强导磷激活 金字塔5F 5G.)支持鼠标PVR模型中P38信号作用并用FXa抑制器Rivaroxaban大规模阻塞小鼠Dispse或Dispse+FXa诱导的P38磷化 金字塔5H 5I)PAR1抑制器或SB202190阻塞FXa诱导FN上调 金字塔5J 5K)和中断ZO-1蛋白质 金字塔5L 5M).集体结果显示FXa诱发ERPE受PAR1和P38信号调导
图5
FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用ARPE-19细胞用FXa或TGF-BE处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2量化C中显示的西方染色代表组合图像PAR1和ffa-SMAARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后表示p-和ctalP38通过免疫计数分析量化F中显示的西方染色西方小鼠视网膜p-和cal-P-38从指定的处理组西方p38量化H7小鼠/处理组FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控量化FN染色ly2109761PA2SB202190FXa诱发的ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解异性染色率量化ZO-1ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-DET测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用高山市 ABARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2高山市 C级ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2高山市 D级量化西色显示 C级.高山市 E级PAR1和AL-SMA机内创伤性PVR病人免疫合影高山市 F级ARPE-19细胞用FXa处理表示时分(40NM)高山市 G级量化西色显示 F级.高山市 H级西方p-和cal-P-38视网膜从指定的处理组高山市 一量化Westernp38显示 H级.7小鼠/处理组高山市 J大全FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控高山市 K级量化FN染色ly2109761PA2SB202190高山市 L级FXa诱发减少ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解高山市 M级异性染色率量化ZO-1高山市 N级ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-ET高山市 O级测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图5
FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用高山市 ABARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2高山市 C级ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2高山市 D级量化西色显示 C级.高山市 E级PAR1和AL-SMA机内创伤性PVR病人免疫合影高山市 F级ARPE-19细胞用FXa处理表示时分(40NM)高山市 G级量化西色显示 F级.高山市 H级西方p-和cal-P-38视网膜从指定的处理组高山市 一量化Westernp38显示 H级.7小鼠/处理组高山市 J大全FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控高山市 K级量化FN染色ly2109761PA2SB202190高山市 L级FXa诱发减少ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解高山市 M级异性染色率量化ZO-1高山市 N级ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-ET高山市 O级测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用ARPE-19细胞用FXa或TGF-BE处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2量化C中显示的西方染色代表组合图像PAR1和ffa-SMAARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后表示p-和ctalP38通过免疫计数分析量化F中显示的西方染色西方小鼠视网膜p-和cal-P-38从指定的处理组西方p38量化H7小鼠/处理组FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控量化FN染色ly2109761PA2SB202190FXa诱发的ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解异性染色率量化ZO-1ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-DET测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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TGF-ET信号在FXa诱导Fibrosis
FXa与TGF-ET的交叉对话在许多研究中报告,FXa显示TGF-ET信号启动方式包括提高TGF-ET或与TGF-ETRI 28码 , 29有趣的是,在我们的研究中,TGF-Di标志FXa处理后增加 微博5N.与MH病人相比,TGF-Di浓度在创伤性PVR患者静态中显著提高 微博5O).此外,TGF-BER抑制器处理(LY2109761)有效阻塞FXa导出FN表达法和ERPE-19单元ZO-1中断 金字塔5J 5M).dipse+FXa处理小鼠预处理LY2109761也明显减少AT-SMA在这些小鼠中上调 金字塔6A级 6)此外,语义检验显示PVR不太严重,例如用LY2109761预处理小鼠视网膜分治和视网膜折叠比不接收LY2109761 金字塔6C 6D).有趣的是,我们发现FXa没有诱导SMAD2/3下游信号演导ARPE-19单元 补充FigS4)综合这些结果显示TGF-ET信号在FXa诱发纤维化中也发挥了作用
图6
TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA量化A中显示的EA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组C)级dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761基于C的PVR强度分级(E).脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化高山市 A级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA高山市 B级量化A-SMA西方图 A级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组高山市 C级)dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761高山市 D级逐级分解PVR严重性 C级.高山市 E级)脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图6
TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化高山市 A级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA高山市 B级量化A-SMA西方图 A级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组高山市 C级)dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761高山市 D级逐级分解PVR严重性 C级.高山市 E级)脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA量化A中显示的EA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组C)级dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761基于C的PVR强度分级(E).脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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讨论
激活凝聚因子发生机械眼部外伤,尽管 试管内研究表明凝聚因子,如FXa和trombin刺激RPE细胞分解分解分解响应 11 , 16 , 25码 , 30码 - 三十三是否有助于PVR的发源 维沃尚有待确定首次报告FXa电流和ERM大增况且,我们证明FXa刺激RPEEMT 试管内并促成鼠标PVR模型视网膜损伤和纤维化此外,用口服FXa抑制器预处理可大大减轻这些小鼠视障和内核纤维化机械学研究显示FXa分解响应大都受PAR1-P38路径的介导,TGF-ET信号在FXa诱发Fibrosis
PVR启动时间介于机械视觉创伤后2周至6个月之间 一号兔子模型中,开球外伤立即增加并峰值3天后逐步下降,闭球外伤增加并持续最长28天,表示机眼外伤后增加维特累FXa可参与PVR生成此外,我们发现FXa水平显著提高,创伤PVR病人的振荡比有凸洞的病人高得多。Ricker等 12RD从两个月内开发PVR的病人中收集的子脉冲液高阻抗作用报告,这些病人与那些没有后发PVR的病人一样,两个月内开发PVR,尽管发现两组对阵列各种参数没有意义尽管如此,RD病人高组织因子水平与视觉错乱相关联(即延长雄性分治时间和更差预视敏锐性),表示脉冲分解因子的病理作用况且,Bastiaans等 16报告称,与RD没有PVR开发的病人相比,静态PVR 16和结果一致整体上,这些研究支持内核成因作用
检验FXa在PVR病理生成中的实际作用 维沃中使用脱机鼠标PVR模型 18号 , 23号 , 34号鼠兔成功引导PVR使用外科干预或注入细胞,例如Fiblasts或RPE细胞或分解 23号 , 35码注入细胞促进PVR快速开发并被广泛使用,然而,大量RPE细胞插入眼中使得它不适合当前研究相形之下,分片注入提供相对安全并可复制PVR模型,不引入外生细胞 18号14天分解注入有效触发PVR开发,包括视网膜分治和纤维化扩散协同FXa推广重光机有趣的是,我们发现光FXa并不足以促进PVR开发BRB分解和RPE细胞受振荡组件影响已知处置条件与PVR开发相关 一号蛋白酶分解可能刺激相似病理条件,使RPE细胞接触FXa等微分分解因子idose+FXa处理方式与dispase或FXa处理方式相比,ffa-SMA表达方式确实大增,支持FXa从鼠标PVR模型分解分解效果
FXa抑制器Rivaroxaban和trombin抑制器digatran经临床批准出血失序 36号 , 37号测试微信机鼠标模型中这些抗coagiants的治疗效果Rivaroxaban和Daigatran在改善PVR方面起到有益作用,因为这两种抑制器有效减少EA-SMA表达方式并减少视网膜结构破坏和视网膜分治失序和FXa处理小鼠,Rivaroxaban比daigatran显示更好的治疗效果未来临床研究需要验证结果,然而FXa和strombin抑制器效果可能值得测试机械眼部创伤病人,因为他们极易开发PVR前几次研究显示口服抗凝胶的最大安全问题是出血 36号实验中,我们也观察到小鼠经Rivaroxaban或daigatran处理后出现非异常内出血眼内出血被视为开发PVR的风险因素,因此发生内出血可能抵消口服抗coa未来研究应确定应用机械眼部外伤后口服抗凝胶的最佳时间和用量
FXa与TGF-ET路径交互联系在许多研究中都报告!FXa显示通过PAR1依赖机制激活潜伏TPF-ET 38号PAR1抑制TGF-ETI信号测试TGF-ETRI绑定和PAR1激活TGF-ETRII绑定 29研究显示MRNA表达式TGF-Di调控FXa启发效果,FXa诱发ERPEEMT可通过TGF-ETRI/II抑制器松散,建议TGF-ET信号作用FXa诱导分化效果然而,在ARPE-19细胞中FXa处理后,我们没有观察到SMAD2/3磷激活 补充FigS4TGF-BET2诱发FN表达式不受PAR1击倒影响 补充FigS5)FXa如何与RPE细胞TGF-ET路径交互需要进一步研究
最后发现FXa显微流出外伤PVR和兔子眼部机眼外伤显示FXa通过RPE激活机制促进内核纤维化最重要的是,FXa抑制器应用大大减轻小鼠分解和FXa诱导视波损伤和内膜纤维化总体说来,我们的数据直接证明FXa抑制小鼠PVR开发,表示锁定FXa可能成为治疗PVR的潜在治疗策略
感知感知
由中国自然科学基金会(81838026 8190828 8180817)和天津自然科学基金会(18ZXDSY00030)支持
披露: H.汉市无; X.赵市无; M.辽无; Y. Song无; C.你无; X.东市无; X.杨无; X.Wang无; .b.黄四郎无; M.杜无; H.延市无
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图1
受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高代表组合FXA和RPE65免疫从TPVR病人和PVR病人分离出膜量化FXa染色C)富士氏度远高于macle洞ELISA测量兔子模型开球伤害ELISA测量兔子模型闭合地球损耗n=5动物/时点数据显示为平均++SEM,*P < 0.05**P < 0.01!***P < 0.001
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受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高高山市 A级FXa和RPE65与TPVR病人和PVR病人隔离膜内免疫合影高山市 B级量化FXa染色高山市 C级富士氏丰度远高于macle洞高山市 D级ELISA测量兔子模型开球伤害高山市 E级ELISA测量兔子模型闭合地球伤害n=5动物/时点数据显示为平均++SEM P级< 0.05!网际网际网际网路 P级< 0.01!*** P级< 0.001.
图1
受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高高山市 A级FXa和RPE65与TPVR病人和PVR病人隔离膜内免疫合影高山市 B级量化FXa染色高山市 C级富士氏丰度远高于macle洞高山市 D级ELISA测量兔子模型开球伤害高山市 E级ELISA测量兔子模型闭合地球伤害n=5动物/时点数据显示为平均++SEM P级< 0.05!网际网际网际网路 P级< 0.01!*** P级< 0.001.
受创伤PVR和兔子模型机械眼部创伤的病人的剖面FXa水平显著提高代表组合FXA和RPE65免疫从TPVR病人和PVR病人分离出膜量化FXa染色C)富士氏度远高于macle洞ELISA测量兔子模型开球伤害ELISA测量兔子模型闭合地球损耗n=5动物/时点数据显示为平均++SEM,*P < 0.05**P < 0.01!***P < 0.001
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图2
FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控并进行了下列实验:(A)ARPE-19细胞内紧接点蛋白ZO-1代表卷式荧光图片计算ZO-1不连续染色率ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极度细胞极性指数量化e.f.测量RPE细胞扩散brdU解析G)CCK8测试ERP细胞可行性测量24小时FXa或TGF-ET由scrach解析处理后RPE细胞迁移数组RPE细胞迁移区跨行迁移分析ARPE-19用FXa处理8H迁移单元格数通过检查六块随机字段图解量化数据显示为平均++SEMP < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控件,并进行了下列实验:(a) A级代表接合蛋白ZO-1ERPE-19细胞高山市 B级量化不连续染色率ZO-1高山市 C级ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极性高山市 D级细胞极性指数量化高山市 英法)测量RPE细胞扩散brdU解析高山市 G级CCK8测试ERP细胞可行性高山市 H级测量24小时FXa或TGF-ET处理Scratch解析高山市 一数组RPE细胞移位高山市 J大全遍历迁移分析ARPE-19用FXa处理8H高山市 K级移位单元格数通过检查六块随机字段图像量化数据显示为平均++SEM* P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图2
FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控件,并进行了下列实验:(a) A级代表接合蛋白ZO-1ERPE-19细胞高山市 B级量化不连续染色率ZO-1高山市 C级ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极性高山市 D级细胞极性指数量化高山市 英法)测量RPE细胞扩散brdU解析高山市 G级CCK8测试ERP细胞可行性高山市 H级测量24小时FXa或TGF-ET处理Scratch解析高山市 一数组RPE细胞移位高山市 J大全遍历迁移分析ARPE-19用FXa处理8H高山市 K级移位单元格数通过检查六块随机字段图像量化数据显示为平均++SEM* P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
FXa损耗RPE紧接和极化并促发细胞扩散和迁移ARPE-19细胞用FXa或TGF-BET2处理24小时正控并进行了下列实验:(A)ARPE-19细胞内紧接点蛋白ZO-1代表卷式荧光图片计算ZO-1不连续染色率ARPE-19细胞抓取并贴上反GM130标签测量细胞极度细胞极性指数量化e.f.测量RPE细胞扩散brdU解析G)CCK8测试ERP细胞可行性测量24小时FXa或TGF-ET由scrach解析处理后RPE细胞迁移数组RPE细胞迁移区跨行迁移分析ARPE-19用FXa处理8H迁移单元格数通过检查六块随机字段图解量化数据显示为平均++SEMP < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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图3
FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降a) 检测ARPE-19细胞中的FNmRNA表达式-qRT-PCR处理FXa或TGF-ETFN,fronectinERPE-19用FXa处理(25NM)或TGF-B2测量FN10ng/mL相对FN表达式量化ARPE-19细胞内FN无线标签24小时使用FXa或TGF-BET2处理Neclei与DAPI染色量化FN染色代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、Dispse(0.02U)、FXa(40NM)或dispase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA逐级分解PVR严重性Hi.西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组J.)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜K.)D显示不连续率ZO-1染色度量化值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降高山市 A级FXa或TGF-ET使用qRT-PCR处理的ARPE-19细胞中FN mRNA表达式检测FN,fronectin高山市 B级Westblot测量ARPE-19细胞FXa(25NM)或TGF-BET210NG/mL高山市 C级相对FN表达式(正规化GAPDH)量化高山市 D级FXa或TGF-BE224小时处理的ERPE-19单元FN隐式标签Neclei与DAPI染色高山市 E级量化FN染色高山市 F级代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、depasese(0.02U)、FXa(40NM)或depase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA高山市 G级逐级分解PVR严重性高山市 HI)西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组高山市 J大全)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜高山市 K级)内显示不连续率ZO-1染色度量化 D级.值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图3
FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降高山市 A级FXa或TGF-ET使用qRT-PCR处理的ARPE-19细胞中FN mRNA表达式检测FN,fronectin高山市 B级Westblot测量ARPE-19细胞FXa(25NM)或TGF-BET210NG/mL高山市 C级相对FN表达式(正规化GAPDH)量化高山市 D级FXa或TGF-BE224小时处理的ERPE-19单元FN隐式标签Neclei与DAPI染色高山市 E级量化FN染色高山市 F级代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、depasese(0.02U)、FXa(40NM)或depase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA高山市 G级逐级分解PVR严重性高山市 HI)西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组高山市 J大全)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜高山市 K级)内显示不连续率ZO-1染色度量化 D级.值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
FXa推广RPE细胞和PVR鼠标模型矩阵沉降a) 检测ARPE-19细胞中的FNmRNA表达式-qRT-PCR处理FXa或TGF-ETFN,fronectinERPE-19用FXa处理(25NM)或TGF-B2测量FN10ng/mL相对FN表达式量化ARPE-19细胞内FN无线标签24小时使用FXa或TGF-BET2处理Neclei与DAPI染色量化FN染色代表OCT、视网膜fundus图像和12周C57小鼠H&E语法,这些小鼠接收内部BSA、Dispse(0.02U)、FXa(40NM)或dispase+FXa右面板显示框区放大率更高D+FDSE+FXA逐级分解PVR严重性Hi.西方线程和密度测量分析C57鼠视网膜中α-SMA表达式从vitrealdipse(0.02U)或Fxa(40NM)接收相对表示a-SMA并归并GAPDH++3小鼠处理组J.)ERP整堆C5712周鼠接受分解或FXa处理图像取自赤道视网膜K.)D显示不连续率ZO-1染色度量化值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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图4
鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化dispse+FXa小鼠带或不带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXAB 基于A的PVR强度分级C)级西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜量化C显示的YA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理digatran达比加特兰光片机强度梯度基于E西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式H.)西方A-SMA蛋白表达式量化GAL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01
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鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化高山市 A级dispse+FXa小鼠带或带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXA高山市 B级逐级分解PVR严重性 A级.高山市 C级)西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜高山市 D级量化A-SMA西方图 C级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组高山市 E级dispse+FXa小鼠带或不带预处理达比加特兰高山市 F级逐级分解PVR严重性 E级.高山市 G级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式高山市 H级)西方A-SMA蛋白表达式量化 G级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01
图4
鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化高山市 A级dispse+FXa小鼠带或带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXA高山市 B级逐级分解PVR严重性 A级.高山市 C级)西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜高山市 D级量化A-SMA西方图 C级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组高山市 E级dispse+FXa小鼠带或不带预处理达比加特兰高山市 F级逐级分解PVR严重性 E级.高山市 G级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式高山市 H级)西方A-SMA蛋白表达式量化 G级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01
鼠标PVR模型中口服FXa或trombin抑制器减轻骨内纤维化dispse+FXa小鼠带或不带预处理RivaroxabanRab,RivaroxabanD+FDSE+FXAB 基于A的PVR强度分级C)级西方烟雾分析a-SMA从指定的处理组对小鼠视网膜量化C显示的YA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理digatran达比加特兰光片机强度梯度基于E西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA表达式H.)西方A-SMA蛋白表达式量化GAL-SMA蛋白表达式归并GAPDH7小鼠/处理组值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01
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图5
FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用ARPE-19细胞用FXa或TGF-BE处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2量化C中显示的西方染色代表组合图像PAR1和ffa-SMAARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后表示p-和ctalP38通过免疫计数分析量化F中显示的西方染色西方小鼠视网膜p-和cal-P-38从指定的处理组西方p38量化H7小鼠/处理组FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控量化FN染色ly2109761PA2SB202190FXa诱发的ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解异性染色率量化ZO-1ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-DET测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用高山市 ABARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2高山市 C级ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2高山市 D级量化西色显示 C级.高山市 E级PAR1和AL-SMA机内创伤性PVR病人免疫合影高山市 F级ARPE-19细胞用FXa处理表示时分(40NM)高山市 G级量化西色显示 F级.高山市 H级西方p-和cal-P-38视网膜从指定的处理组高山市 一量化Westernp38显示 H级.7小鼠/处理组高山市 J大全FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控高山市 K级量化FN染色ly2109761PA2SB202190高山市 L级FXa诱发减少ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解高山市 M级异性染色率量化ZO-1高山市 N级ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-ET高山市 O级测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图5
FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用高山市 ABARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2高山市 C级ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2高山市 D级量化西色显示 C级.高山市 E级PAR1和AL-SMA机内创伤性PVR病人免疫合影高山市 F级ARPE-19细胞用FXa处理表示时分(40NM)高山市 G级量化西色显示 F级.高山市 H级西方p-和cal-P-38视网膜从指定的处理组高山市 一量化Westernp38显示 H级.7小鼠/处理组高山市 J大全FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控高山市 K级量化FN染色ly2109761PA2SB202190高山市 L级FXa诱发减少ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解高山市 M级异性染色率量化ZO-1高山市 N级ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-ET高山市 O级测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
FXa通过PAR1-P38信号引导RPEEMT和TGF-ET信号也发挥了作用ARPE-19细胞用FXa或TGF-BE处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示PAR1和PAR2ARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后用Westernblot分析cleftPAR1表达式PAR1和PAR2量化C中显示的西方染色代表组合图像PAR1和ffa-SMAARPE-19细胞用FXa处理(40NM)表示时分,然后表示p-和ctalP38通过免疫计数分析量化F中显示的西方染色西方小鼠视网膜p-和cal-P-38从指定的处理组西方p38量化H7小鼠/处理组FXa诱导调控ARPE-19细胞由Parmodulin2LY2109761或SB202190(P38MAPK抑制器)调控量化FN染色ly2109761PA2SB202190FXa诱发的ZO-1蛋白通过Parmodulin22预处理LY2109761或SB202190得到缓解异性染色率量化ZO-1ARPE-19细胞用FXa或TGF-ET处理24小时,然后qRT-PCR检测mRNA表示TGF-DET测量TPVR病人和MH病人静态TGF-ET值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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图6
TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA量化A中显示的EA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组C)级dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761基于C的PVR强度分级(E).脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化高山市 A级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA高山市 B级量化A-SMA西方图 A级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组高山市 C级)dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761高山市 D级逐级分解PVR严重性 C级.高山市 E级)脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
图6
TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化高山市 A级西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA高山市 B级量化A-SMA西方图 A级.AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组高山市 C级)dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761高山市 D级逐级分解PVR严重性 C级.高山市 E级)脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM P级< 0.05,** P级< 0.01,*** P级< 0.001.
TGF-ETR阻抗块FXa诱发内膜纤维化西方烟雾分析指定处理组小鼠视网膜中的α-SMA量化A中显示的EA-SMA西方块AL-SMA蛋白表达式归并GAPDH++4小鼠/处理组C)级dispse+FXa小鼠H&E保留视网膜带带或不预处理TGF-ETR抑制器LY2109761基于C的PVR强度分级(E).脉冲外伤后富士水平大幅提高,这可能与RPE发生接触并促发RPE细胞激活FXa激活RPE细胞PAR1并随后激活P38信号以推广PRE细胞的米氏变换,包括干扰上皮紧接点并增加ECM蛋白表达式同时TGF-ET信号在RPE细胞FXa诱发EMT中也发挥了作用值表示++SEM,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001
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补编第1号
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